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10x Genomics空间转录组测序
背景介绍
基因表达具有时间特异性和空间特异性。时间特异性通常可以通过对不同时间点的样本取材，再使用单细胞转录组测序技术来进行解析。然而，空间特异性信息常常难以获得。常规转录组测序和单细胞转录组测序无法还原细胞所处的原始位置信息，而传统的原位杂交技术又很难实现高通量检测。 10x Genomics Visium空间转录组技术，可在组织原位以超高分辨率研究基因表达特征和空间分布。此外，结合单细胞转录组和空间转录组进行联合研究，可使空间位置的基因表达研究深入到超高分辨率的单细胞层次，对于癌症、免疫、神经、发育等领域，有着令人期待的应用前景。
不同层面转录组研究
技术原理
对新鲜冷冻组织或FFPE组织进行包埋和切片，并将其放置在基因表达玻片上的捕获区内（新鲜冷冻组织需先摸索组织切片的目标区域透化条件 , 以便确定透化最佳条件）。基因表达芯片有4个点阵区域（6.5mmx6.5mm） ，每个点阵均含有4,992个 barcoded spot（直径为55 μm），每个spot有一个独特条形码序列用于位置定位。进行H&E染色后，在明场显微镜下观察玻片上的组织切片，之后对组织进行透化处理，以释放出细胞中的mRNA（新鲜冷冻组织）或连接的探针对（FFPE组织） 。这些mRNA或探针对与spot上带有空间条形码的寡核苷酸相结合。通过生成cDNA的逆转录反应（新鲜冷冻组织）或延长反应（ FFPE组织）引入空间条形码。将带有条形码的分子混合后进行下游处理，制备出立即可测序的文库。生成的10x条形码文库与Illumina测序仪上的标准短读长NGS测序兼容，能够实现整张组织切片的大规模转录分析。测序数据中空间条形码序列将转录信息映射回组织切片中的起始位置，从而还原转录本在组织中的位置分布，实现基因表达的空间可视化。
Visium空间基因表达玻片的组成
注： 每张玻片包含2个或4个捕获区，每个捕获区含有约5,000个带有条形码的数据点，而每个数据点又包含数百万条带空间条形码的捕获寡核苷酸。组织mRNA在释放后与这些寡核苷酸结合，可实现基因表达信息的捕获。
Visium空间基因表达的流程图
注： 对新鲜冷冻组织或FFPE组织进行切片，并将其放置在文库制备玻片上，然后进行固定，通过H&E或免疫荧光（IF） 染色并成像，接着添加空间条形码并构建文库。对制备好的文库进行测序，并对数据进行可视化。
结果展示
分群可视化结果（左）；Spots分群图（中）；Marker基因表达热图（右）
亚群聚类热图（左）；基因Term关系网络图（中）；GSEA富集分析（右）
产品优势
双重信息
实现基因表达数据与空间定位信息的结合，解析多种类型组织切片样本中基因表达谱；
分辨率高
每个芯片点阵包含近5,000个spot，每个spot平均分辨率为1至10个细胞，可以检测几千个基因；
结果无偏
无需组织解离，保留组织结构及细胞微环境，鉴定异质性组织中细胞类型；特殊UMI设计，避免反转录偏好性，降低误差；
FFPE兼容
突破从FFPE（石蜡包埋）组织中获取空间基因表达信息的障碍；
平台完善
具有冷冻切片机、超高分辨率显微镜、 10x Genomics Visium等服务平台；
团队专业
中科院博士带领专业实验团队。现已累积50余种不同组织类型、数百余个样品的空间转录组实验经验。
送样要求
与单细胞联合分析
单细胞转录组测序能很好的揭示了组织异质性，但由于获取细胞悬液时对组织进行了酶解，从而导致组织空间位置信息丢失。而空间转录组测序技术可以同时提供空间位置信息和基因表达信息，但检测的单位不是单细胞水平，综合运用单细胞检测技术和空间转录组检测技术将两种检测结果进行联合分析，对空间转录组的检测结果进行精确的细胞类型注释，从而在不同应用场景中更加精准的揭示细胞相互作用和组织理解。
空间转录组和单细胞转录组整合研究应用场景
应用方向
肿瘤研究： 肿瘤微环境、肿瘤异质性；
免疫研究： 免疫微环境；
发育生物学： 细胞类型的空间分布、时空变化；
脑神经学： 神经系统研究、脑图谱构建；
病理学： 病例切片的空间基因表达信息；
细胞图谱： 构建三维空间图谱。
应用案例
单细胞分辨率下人类肠道发育的时空分析
Spatiotemporal analysis of human intestinal development at single-cell resolution
发表杂志： Cell（IF: 41.582）； 发表时间： 2021年 2月； 应用技术： 10x Genomics单细胞转录组测序， 10x Genomics空间转录组测序
本研究将单细胞转录组测序和空间转录组测序进行联合，绘制了随时间变化的肠道形态发生。确定了101个细胞状态，包括上皮细胞和间充质祖细胞群以及与关键形态发生相关的重要阶段过程。描述了隐窝-绒毛轴形成的原理，神经、血管、间充质形态发生和肠道的免疫种群，鉴定了发育中的成纤维细胞和肌纤维细胞亚型的分化层次，并阐述了它们的不同功能。明确了佩尔斑和肠道相关淋巴组织的起源，并描述了位置特异性免疫程序。本研究使用这一资源来呈现了形态发生梯度的无偏分析，这一梯度能够指导细胞分化的连续波并定义与罕见发育性肠道疾病相关的细胞和位置，汇编了一个公开可用的在线资源，即胎儿肠道发育的时空分析资源（STAR-FINDer），以期促进后续的相关研究工作。
肠发育图谱研究技术路线
空间转录组和单细胞转录组测序整合对肠道发育的时空分析
